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    T7體外轉錄試劑盒

    簡要描述:T7體外轉錄試劑盒是利用T7 RNA Polymerase進行體外轉錄(in vitro transcription),大量合成siRNA的試劑盒。

    • 更新時間:2022-12-11
    • 廠商性質:生產廠家
    • 生產地址:上海
    • 訪  問  量:380

    詳細介紹

    品牌自營品牌CAS/
    分子式/純度詳詢
    分子量/貨號YLK10355P
    規格50T供貨周期現貨
    主要用途科研應用領域化工,生物產業

    T7體外轉錄試劑盒是利用T7 RNA Polymerase進行體外轉錄(in vitro transcription),大量合成siRNA的試劑盒。試劑盒使用了T7 RNA Polymerase,以含有T7 Promoter序列的線型雙鏈DNA為模板,可以對Promoter下游的DNA序列進行轉錄,高效合成單鏈RNA。試劑盒中附帶有Control Template(線型Plasmid DNA),以20 ng的Control Template為模板,在20 μl的轉錄反應體系中,可以合成約10 μg的2 kb單鏈RNA。另外,本試劑盒含有RNase T1,該酶可特異性切斷單鏈RNA的鳥苷酸3’端的磷酸。體外轉錄反應后可以合成siRNA。

    (注意)T7體外轉錄試劑盒適用于合成大量RNA,不推薦用于制作高比活性的RNA probe。

    ●    保   存:-20℃

    ●    實驗操作注意

    1.     反應體系中須嚴格注意不要混入 RNase。

    2.     實驗器材(如:槍頭、Microtube 等)注意嚴格使用 RNase Free 用品。

    3.     實驗操作時請注意戴一次性手套,防止 RNase 污染。


        模板 DNA 的制備

    含有 T7 啟動子,線性化質?;?PCR 擴增產物可以作為模板。

    T7 啟動子序列

    23.png

    粗體字+1 的 G 開始轉錄 RNA。

    1.   質粒作為模板

    向含有 T7 啟動子的質粒載體中插入目的 DNA,然后用限制酶進行處理。這時,在啟動子區域右側、插入DNA 片段的下游,使用在插入 DNA 片段中無識別位點的限制酶對質粒進行線性化處理。請使用能形成 5’ 突出或者平滑末端的限制酶。反應結束后,進行 Proteinase K 處理及精制反應。


    1)  限制酶反應液中,加入終濃度為 100 μg/ml 的 Proteinase K 與終濃度為 0.5%的 SDS。

    2)  37℃反應 30 分鐘。

    3)  TE 飽和的苯酚/氯仿處理。


    4)  加入 1/10 體積的 3 M 醋酸鈉及 2.5 倍體積的乙醇進行乙醇沉淀。

    5)  離心回收的 DNA 沉淀用 80%乙醇洗凈處理。

    6)  RNase-free TE Buffer 溶解。


    24.png


    2.   PCR 擴增產物作為模板

    T7 啟動子(TAATACGACTCACTATAGGG)添加在 sense primer 的 5’端(這時,在 T7 啟動子序列的上游添加 6~10 個核苷酸可以更有效地促進 T7 RNA polymerase 結合并合成 RNA)、或者插入目的片段的質粒 DNA 的 T7 啟動子上游設定 sense primer 及 anti-sense primer 進行 PCR 擴增。擴增產物可使用 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Code No. 740609 .10/.50/.250)進行精制。

    25.png

    ●    DNase 處理

    如果想要除去 DNA,轉錄反應后按下面方法進行 DNase 處理。

    (1)   轉錄反應后,向其中加入 10~20 U/20 μl 反應液的 RNase free DNase I,混勻。

    (2) 37℃反應 30 分鐘。

        轉錄 RNA 精制

    A.   按照下面方法進行苯酚/氯仿抽提、異丙醇沉淀。

    反應液體積低于 100 μl 時,加入 RNase free dH2O 補足至 100 μl。

    (1)    加入等體積的苯酚(pH4.5)/氯仿/異戊醇(25:24:1),vortex 攪拌,12,000 rpm 室溫離心 2分鐘。

    (2)    上層(水層)移至新 tube 中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1),vortex 攪拌,12,000 rpm室溫離心 2 分鐘。

    (3)    上層(水層)移至新 tube 中,加入 1/10 體積的 3 M 醋酸鈉、等體積的異丙醇,充分混合均勻。

    (4)    室溫放置 5 分鐘后,15,000 rpm 室溫離心 5 分鐘。

    (5)    除去上清,80%乙醇洗凈沉淀。

    (6)    干燥后加入 RNase free dH2O 或者 TE Buffer 溶解沉淀。

    (7)    如有必要,可小量分裝保存于-20℃~-70℃。

    B.  也可以使用下述商業化產品(當 transcript RNA size>200 bases) NucleoSpin RNA Clean-up(740948.10/740948.50/740948.250) NucleoSpin RNA Clean-up XS(740903.10/740903.50/740903.250)

        制作 siRNA

    按照下面的方法利用本試劑盒可以制作 siRNA。

    〔概要〕

    <Step 1>

    制備向 T7 啟動子序列附加 siRNA 序列的雙鏈 DNA Oligonucleotide 兩組。

    26.png

    ●    參考文獻

    (1)   Davanloo, P., Rosenberg, AH., Dunn, JJ., Studier, FW.Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. : Proc Natl Acad Sci USA. (1984) 81: 2035-2039.

    (2)   Browning, K S. Transcription and translation of mRNA from polymerase chain reaction-generated DNA. Amplifications. (1989) 3: 14-15.

    (3)   Schenborn, E T. and Mierendorf Jr, R C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerase : dependence on template structure. Nuc Acids Res. (1985) 13: 6223-6236.

    (4)   Heinonen, J E., Smith, CI., and Nore, B F. Silencing of Bruton's tyrosine kinase (Btk) using short interfering RNA duplexes (siRNA). FEBS Letter. (2002) 527: 274-278.


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