中文名稱：免RNA提取RT-PCR試劑盒

英文名稱：Cell Lysate RT-PCR Kit

規格及成分

使用方法

注意：無 RNase 的環境和使用無 RNase 污染的試劑是本實驗成功的關鍵。

強烈建議使用優利科的固相 RNase 清除劑去除工作臺面的 RNase，用氣相

RNase 去除空氣中的 RNase。實驗前需要將 95%乙醇放-70℃預冷，最好用空槍頭盒盛乙醇。

一、細胞培養、裂解

1.     按常規方法培養細胞、胰/酶消化并計數。

2.     轉移 1×10E5 個細胞到離心管中，400×g 離心 4 分鐘。

3.     吸棄上清（即培養基），保留細胞沉淀。

4.     用 0.5 mL 溶液 A 重懸細胞，并將細胞濃度調整到 2×10E5 細胞/mL。

5.     轉移 10 µL 的懸浮細胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 µL 的溶液 B，此時細胞終濃度為 10E5 細胞/mL。

6.     迅速將離心管插入浮子中，放入-70℃預冷的、95%乙醇中 1-3 分鐘。10 µL 槍頭盒一般能讓 0.2 mL 的 PCR 管一半沒入到乙醇中。

7.     在室溫的水浴鍋中快速解凍細胞，渦旋 10 秒后短暫離心數秒，將管中液體

（細胞裂解液）轉移到新的離心管中，放冰上待用。

二、RT（逆轉錄）反應合成 cDNA

8.     按下表設置 RT 反應體系（以 20 µL 體系為例）:

9 .     2℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

10.     70℃保溫 10 分鐘以終止反應，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。也可以放置在-20℃長期保存。

三、PCR 方案一（RT 產物全部用于 PCR）

11.     在上步的 RT 反應管中直接按下表加入各成分（以 100 µL 體系為例）：

   12.    直接進入第 14 步。

四、PCR 方案二（部分 RT 產物用于 PCR）

13.    按下表設置 PCR 反應體系（以 30 µL 體系為例）：

注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14.    PCR 反應參數(需要根據模板和引物 Tm 值決定，下面的參數只做參考)：

五、電泳檢測

15.    取 5-10 µL PCR 產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標準比較估計出擴增產物的大小。注：本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要額外再加電泳上樣液。

免RNA提取RT-PCR試劑盒特點如下：

1.     免 RNA 提取，從細胞裂解到 RT-PCR 或實時定量 RT-PCR 結果只需三個步驟，省略了整個 RNA 提取過程。

2.     靈敏度不低于常規方法（先提總 RNA 再進行 RT-PCR），不但可以檢測到低拷貝的 RNA，還可用于檢測 miRNA。

3.     整合了去除基因組 DNA 的步驟，只檢測 RNA，無需擔心基因組 DNA 的污染。

4.     每次只需要 10-100000 個培養細胞或含相應細胞數的痕量組織（如 LCM 樣品），驗證過的細胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于 U937 細胞系。

5.     兩步法 RT-PCR，后續使用靈活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的熒光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan）， 非常靈活。

6.     即適用于少量樣品，也適用于平行處理大量樣品及高通量篩查。

7.     本產品足夠用于 50 次 20µL 體系的 RT 和 600 次 30µL 體系（或約 200 次100µL 體系）的 PCR。