一步式染料法qRT-PCR試劑盒

本產品是基于熒光染料檢測的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對靶 RNA 分子進行實時定量RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產品含有經過優化的緩沖液組分、逆轉錄酶、熱啟動 Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩定劑、dNTPs、MgCl2 和穩定劑等所有實時定量 RT-PCR 所需要的成分，用戶只需加入 RNA 模板和引物即可進行染料法實時定量 RT-PCR 反應，具有廣泛的用途。

中文名稱：一步式染料法qRT-PCR試劑盒

英文名稱：One-Step SYBR qRT-PCR Kit

規格及成分

低溫運輸，-20℃保存, 不凍融時保存期限為 12 個月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三周。

自備試劑：RNA 模板、引物、超純水。

一步式染料法qRT-PCR試劑盒具有下列特點：

1.以 2×Mix 提供，用戶只需準備模板、引物和 ROX 染料（取決于 qPCR 儀器）即可以進行染料法實時定量 RT-PCR 實驗，非常方便快捷，降低了操作誤差。 2.各成分的濃度和比例都經過精心優化，反應的靈敏度高，特異性強。靈敏度最高時可以達到 50 拷貝/反應（跟模板質量，引物設計等相關）。3.靈敏度和專一性比常規 RT-PCR 更高。 4.可用于基因表達分析、SNP 分析、拷貝數分析等實驗。也可以用于定性檢測。5.本產品只能用于科研，1mL 足夠 100 次 20uL 體系的染料法 qRT-PCR 反應。

使用方法:

如果有 N 個樣品并且做定量分析，最好設置 N+7 個反應，多出的 7 個中，6 個是做標準曲線的陽性對照，一個是陰性對照（NC）。在 N+7 個 PCR 管中，加入下列成分。如果是做定性分析，則 6 個做標準曲線的樣品縮減成一個陽性對照（PC），用戶自己需要根據下表進行適當修改（把 6 個標曲反應改成 1 個陽性對照反應）。

成分N 個樣品管6 個標準曲線管NC 管2×染料法 qRT-PCR 緩沖液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL自備引物 1（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL自備引物 2（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uLN 個自備模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加自備陽性對照模板（6 個梯度） 不加 各 1 uL（1 管加 1 個梯度） 不加陰性對照模板（水） 不加 不加 1 uL自備 50×ROX I 染料或自備 50×ROX II 染料（見注）各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL補超純水到 20 uL 20 uL 20 uL

注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊為準。1、不需要 ROX 的機型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型號的熒光 PCR 儀器不需要加 ROX 染料，但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。2、需要使用 ROX I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、StepOne Plus。3、需要使用 ROX II 的機型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。2. 放入熒光 PCR 儀中進行擴增, 下表的擴增參數僅供參考，一定需要根據靶分子長度，引物的 Tm 值等進行調節。一般選擇三步法 PCR：

數據處理如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性。一般情況下，陰性對照 Ct 大于或等于 40（閾值需要以陰性對照的 Ct 值確定，此處為便于敘述以 40 為例，具體情況很可能閾值不一樣）。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。