兩管式RT-PCR試劑盒（AMV-Taq）

中文名稱：兩管式RT-PCR試劑盒（AMV-Taq）

英文名稱：Two-Tube  RT-PCR Kit（AMV-Taq）

本產品使用重組禽類成髓纖維病毒逆轉錄酶(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, AMV RT)，從總 RNA 或者 Poly(A)+ RNA 合成第一鏈 cDNA 的試劑盒，含有 cDNA 第一鏈合成所需的所有試劑。AMV RT 具有 RNA 聚合酶活性和 RNase H 的活性，能夠作用于 GC 含量高，二級結構復雜的 RNA。合成的第一鏈 cDNA 可廣泛應用于第二鏈合成、雜交、PCR 擴增、Real-time PCR 反應等。

包裝及成分：

兩管式RT-PCR試劑盒（AMV-Taq）具有以下特點：

1.即開即用，足夠 50 次 RT 反應（20μL 體系）和 600 次 PCR 反應（30μL 體系）。

2.cDNA 第一鏈合成試劑盒可靈活選用隨機引物、Oligo dT 引物或基因專一引物，適合各種情況。

3. 兩管式操作，RT 和 PCR 在不同試管中進行，便于單獨優化 RT 反應或 PCR 反應條件。

4.全長的第一鏈 cDNA 產量高，最長可合成 8 kb 的 cDNA。

注意事項： 

1.RNA 樣品要避免基因組 DNA 污染。用于 cDNA 合成的器具須用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液 37℃浸泡 12 h；然后在 120℃高壓滅菌 30 min 去除殘留的 DEPC。

2. 用于 RNA 實驗的試劑，須使用干熱滅菌(180℃，60 min)或者上述 DEPC 處理的器具盛裝，使用的無菌水須用 0.1% DEPC 處理后進行高溫高壓滅菌。建議 RNA 實驗使用的器具、試劑和無菌水專用。

3. 不必從總 RNA 中分離 Poly(A)+ mRNA，但以 Poly(A)+ mRNA 為模板可以提高終產物得率和純度。

4. 盡管以 Oligo dT 作引物無需優化，但隨機六合引物和 RNA 的比例對于 cDNA 合成產物的平均長度非常關鍵，提高隨機六合引物/RNA 的比值將導致短鏈 cDNA (500 bp)產量升高而減少，此比值則有利于長鏈 cDNA 的合成。

5. 提高反應溫度到 50℃有利于解決富含 GC 二級結構的 mRNA 問題。AMV RT 的熱穩定性相對于 M-MuLV 較好，在 37-50℃有較高活性。

6. cDNA 產物應置于-20℃保存。實驗操作時應將酶置于冰上，實驗結束后于-20℃保存。

常見問題：

1.    反轉錄引物的選擇

a.    用于第一鏈 cDNA 合成的引物，oligo dT 有利于長鏈 cDNA 的合成，使用該引物只需42℃進行反轉錄即可，無需 25℃預熱。

b.    隨機引物適合于 500 bp 以下的短鏈 cDNA 的合成，所轉錄的 RNA 模板無需 poly(A)尾，可轉錄 5'端區域。使用該引物前須將引物進行 25℃溫浴。

c.    基因特異性引物主要用于合成特定基因片段長度的 cDNA。

2.   第一鏈 cDNA 合成原理及產物檢測

a. cDNA 的合成是以 mRNA 為模板，以隨機引物或者基因特異性引物或者 oligo dT 為引物，在反轉錄酶的催化下從 5'→3'合成第一鏈 cDNA。